核酸檢測的方法原理和流程

因為新冠疫情的影響，為了配合疫情的防控，很多地方都需要進(jìn)行核酸檢測，那么你知道核酸檢測的流程是怎樣的嗎？下面是小編整理的核酸檢測的方法原理和流程，歡迎大家閱讀分享借鑒。

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核酸檢測是怎樣檢測的

眾所周知，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是一種烈性呼吸道傳染病，其病原體為新型冠狀病毒。若想證實已出現(xiàn)的感染癥狀是由本病毒所引起，最準(zhǔn)確的方法是從患者體內(nèi)分離出活病毒，并進(jìn)行病毒培養(yǎng)。

然而，此方法并不適合大面積應(yīng)用，在此次疑似病例的確診工作中，也并不適用。這是因為病毒培養(yǎng)所需時間較長，需要的場所條件也很高(P3級實驗室)，時效性遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上臨床需要。

而核酸檢測作為病原學(xué)的檢測手段之一，效率很高，一般情況下幾個小時就可以知道結(jié)果。因此，在此次疫情中，臨床上取得病原學(xué)證據(jù)的主要方式并不是病毒培養(yǎng)，而是核酸檢測。

核酸是遺傳信息載體，是對DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)的統(tǒng)稱。病毒則主要由遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)組成。而新型冠狀病毒正是一種RNA病毒，其遺傳物質(zhì)是單鏈RNA。核酸檢測的原理，正是檢測在被測者的咽拭子等樣本中，是否存在病毒的RNA。如果存在，說明被病毒感染。那么，我們是否已經(jīng)獲悉了病毒的RNA呢?

在疫情初期，中國疾病預(yù)防控制中心應(yīng)用宏基因組學(xué)技術(shù)，在短時間內(nèi)完成該病毒的鑒定，并獲取了全基因組序列。在病毒全基因組序列公布后，實時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑被快速研發(fā)。

隨后，核酸檢測試劑盒被應(yīng)用于臨床，并為確診新冠肺炎提供病原學(xué)證據(jù)。那么，應(yīng)用試劑盒進(jìn)行核酸檢測，究竟是怎樣的一個過程呢?

首先，檢測人員需要在試劑的幫助下，將樣本中的核酸提取出來。再把已經(jīng)分離出來的核酸加到核酸擴(kuò)增試劑中，然后將其放到核酸擴(kuò)增儀內(nèi)，一般兩個小時內(nèi)就會有結(jié)果。

事實上，在操作步驟中，擴(kuò)增是很重要的一環(huán)。擴(kuò)增的意義在于能讓微量的遺傳信息成指數(shù)增加。只要樣本中有核酸基因片段，就能用PCR法加以放大，從而更清晰地與病毒全基因組序列實現(xiàn)比對。

實時熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法已在臨床實驗室應(yīng)用多年，檢測體系成熟，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測周期短和可定量檢測的優(yōu)點，而且還能對病毒感染程度和治療效果進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測。

中日友好醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科主任醫(yī)師陳欣在記者采訪中介紹道：核酸檢測十分敏感，只要在被檢者的分泌物樣本中找到一部分病毒的核酸，就可以通過RT-PCR擴(kuò)增的方式，整合成序列。

"雖然不確定核酸是否來自于活病毒，但對于有呼吸道感染癥狀的患者或疑似患者來說，如果其咽拭子有這種核酸，一般認(rèn)為來源于活病毒的一部分，間接證實其體內(nèi)存在著病毒的繁殖和感染。" 陳欣告訴記者。

核酸檢測容易出現(xiàn)"假陰性"

雖然核酸檢測有靈敏度高、檢測周期短等優(yōu)點，但也存在著一定的弊端。不同于從人體內(nèi)直接分離出活病毒的方式，核酸檢測采用的是一種間接的方式，有可能造成假陰性。

因為試劑盒存在最低檢測限的問題，所以只有當(dāng)采到的樣本中，病毒的含量達(dá)到一定程度時才能檢測出來。少數(shù)情況下，可能康復(fù)者并未康復(fù)，但由于樣本中病毒載量低，故康復(fù)者核酸檢測的結(jié)果呈陰性，也就是我們常說的"假陰性"。

因此，在《新型冠狀病毒肺炎診療標(biāo)準(zhǔn)(試行第七版)》中，出院標(biāo)準(zhǔn)之一為連續(xù)兩次痰、鼻咽拭子等呼吸道標(biāo)本核酸檢測陰性(釆樣時間至少間隔24小時)。

而之所以選取呼吸道標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測，是因為新冠肺炎屬于呼吸道傳染病，故而優(yōu)先考慮從呼吸道的分泌物中取得標(biāo)本。呼吸道又分為上呼吸道和下呼吸道，前者主要包括鼻、咽、喉;后者主要包括氣管、主支氣管及肺內(nèi)各級支氣管。

相應(yīng)地，現(xiàn)在對疑似患者檢測病毒核酸，標(biāo)本的采集一般有兩大類，上呼吸道標(biāo)本和下呼吸道標(biāo)本。

上呼吸道標(biāo)本主要包括口咽拭子、鼻咽拭子(NPS)、鼻咽吸取物(NPA);下呼吸道標(biāo)本主要包括痰液、氣管吸取物、支氣管肺泡灌洗液(BALF)等。

新型冠狀病毒的核酸檢測流程

對于新型冠狀病毒的核酸檢測，首先根據(jù)試劑盒說明書”樣本要求“部分進(jìn)行樣本采集，常規(guī)的樣本類型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等。

獲得患者樣本后，需盡快進(jìn)行檢測，如無法立即檢測需要轉(zhuǎn)運的樣本，應(yīng)按照說明書的要求進(jìn)行低溫封裝，并送到專門的檢測機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測。檢測機(jī)構(gòu)收到樣本后，對樣本進(jìn)行核酸提取，核酸提取試劑應(yīng)使用批準(zhǔn)產(chǎn)品說明書中指定的核酸提取試劑盒。

病毒RNA需要首先逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行擴(kuò)增檢測。PCR擴(kuò)增和檢測應(yīng)使用批準(zhǔn)產(chǎn)品說明書中指定的熒光定量PCR儀，通過熒光定量PCR所得到的樣本Ct值的大小，可以判斷患者樣本中是否含有新型冠狀病毒。

上述過程中樣本的采集、保存、轉(zhuǎn)運，樣本核酸的提取和檢測、結(jié)果的判讀均須嚴(yán)格按照試劑盒說明書要求進(jìn)行。

新型冠狀病毒核酸檢測原理

檢測新型冠狀病毒特異序列的方法最常見的是熒光定量PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。因PCR反應(yīng)模板僅為DNA，因此在進(jìn)行PCR反應(yīng)前，應(yīng)將新型冠狀病毒核酸(RNA)逆轉(zhuǎn)錄為DNA。在PCR反應(yīng)體系中，包含一對特異性引物以及一個Taqman探針，該探針為一段特異性寡核苷酸序列，兩端分別標(biāo)記了報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收;如反應(yīng)體系存在靶序列，PCR反應(yīng)時探針與模板結(jié)合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針酶切降解，報告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子產(chǎn)生。熒光定量PCR儀能夠監(jiān)測出熒光到達(dá)預(yù)先設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)(Ct值)與病毒核酸濃度有關(guān)，病毒核酸濃度越高， Ct值越小。不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品會依據(jù)自身產(chǎn)品的性能確定本產(chǎn)品的陽性判斷值。