核酸檢測(cè)的方法原理和流程

因?yàn)樾鹿谝咔榈挠绊懀瑸榱伺浜弦咔榈姆揽?，很多地方都需要進(jìn)行核酸檢測(cè)，那么你知道核酸檢測(cè)的流程是怎樣的嗎？下面是小編整理的核酸檢測(cè)的方法原理和流程，歡迎大家閱讀分享借鑒。

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眾所周知，新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)是一種烈性呼吸道傳染病，其病原體為新型冠狀病毒。若想證實(shí)已出現(xiàn)的感染癥狀是由本病毒所引起，最準(zhǔn)確的方法是從患者體內(nèi)分離出活病毒，并進(jìn)行病毒培養(yǎng)。

然而，此方法并不適合大面積應(yīng)用，在此次疑似病例的確診工作中，也并不適用。這是因?yàn)椴《九囵B(yǎng)所需時(shí)間較長(zhǎng)，需要的場(chǎng)所條件也很高(P3級(jí)實(shí)驗(yàn)室)，時(shí)效性遠(yuǎn)遠(yuǎn)跟不上臨床需要。

而核酸檢測(cè)作為病原學(xué)的檢測(cè)手段之一，效率很高，一般情況下幾個(gè)小時(shí)就可以知道結(jié)果。因此，在此次疫情中，臨床上取得病原學(xué)證據(jù)的主要方式并不是病毒培養(yǎng)，而是核酸檢測(cè)。

核酸是遺傳信息載體，是對(duì)DNA(脫氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)的統(tǒng)稱。病毒則主要由遺傳物質(zhì)和蛋白質(zhì)組成。而新型冠狀病毒正是一種RNA病毒，其遺傳物質(zhì)是單鏈RNA。核酸檢測(cè)的原理，正是檢測(cè)在被測(cè)者的咽拭子等樣本中，是否存在病毒的RNA。如果存在，說(shuō)明被病毒感染。那么，我們是否已經(jīng)獲悉了病毒的RNA呢?

在疫情初期，中國(guó)疾病預(yù)防控制中心應(yīng)用宏基因組學(xué)技術(shù)，在短時(shí)間內(nèi)完成該病毒的鑒定，并獲取了全基因組序列。在病毒全基因組序列公布后，實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑被快速研發(fā)。

隨后，核酸檢測(cè)試劑盒被應(yīng)用于臨床，并為確診新冠肺炎提供病原學(xué)證據(jù)。那么，應(yīng)用試劑盒進(jìn)行核酸檢測(cè)，究竟是怎樣的一個(gè)過(guò)程呢?

首先，檢測(cè)人員需要在試劑的幫助下，將樣本中的核酸提取出來(lái)。再把已經(jīng)分離出來(lái)的核酸加到核酸擴(kuò)增試劑中，然后將其放到核酸擴(kuò)增儀內(nèi)，一般兩個(gè)小時(shí)內(nèi)就會(huì)有結(jié)果。

事實(shí)上，在操作步驟中，擴(kuò)增是很重要的一環(huán)。擴(kuò)增的意義在于能讓微量的遺傳信息成指數(shù)增加。只要樣本中有核酸基因片段，就能用PCR法加以放大，從而更清晰地與病毒全基因組序列實(shí)現(xiàn)比對(duì)。

實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)法已在臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用多年，檢測(cè)體系成熟，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、檢測(cè)周期短和可定量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，而且還能對(duì)病毒感染程度和治療效果進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

中日友好醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科主任醫(yī)師陳欣在記者采訪中介紹道：核酸檢測(cè)十分敏感，只要在被檢者的分泌物樣本中找到一部分病毒的核酸，就可以通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增的方式，整合成序列。

"雖然不確定核酸是否來(lái)自于活病毒，但對(duì)于有呼吸道感染癥狀的患者或疑似患者來(lái)說(shuō)，如果其咽拭子有這種核酸，一般認(rèn)為來(lái)源于活病毒的一部分，間接證實(shí)其體內(nèi)存在著病毒的繁殖和感染。" 陳欣告訴記者。

核酸檢測(cè)容易出現(xiàn)"假陰性"

雖然核酸檢測(cè)有靈敏度高、檢測(cè)周期短等優(yōu)點(diǎn)，但也存在著一定的弊端。不同于從人體內(nèi)直接分離出活病毒的方式，核酸檢測(cè)采用的是一種間接的方式，有可能造成假陰性。

因?yàn)樵噭┖写嬖谧畹蜋z測(cè)限的問(wèn)題，所以只有當(dāng)采到的樣本中，病毒的含量達(dá)到一定程度時(shí)才能檢測(cè)出來(lái)。少數(shù)情況下，可能康復(fù)者并未康復(fù)，但由于樣本中病毒載量低，故康復(fù)者核酸檢測(cè)的結(jié)果呈陰性，也就是我們常說(shuō)的"假陰性"。

因此，在《新型冠狀病毒肺炎診療標(biāo)準(zhǔn)(試行第七版)》中，出院標(biāo)準(zhǔn)之一為連續(xù)兩次痰、鼻咽拭子等呼吸道標(biāo)本核酸檢測(cè)陰性(釆樣時(shí)間至少間隔24小時(shí))。

而之所以選取呼吸道標(biāo)本進(jìn)行核酸檢測(cè)，是因?yàn)樾鹿诜窝讓儆诤粑纻魅静。识鴥?yōu)先考慮從呼吸道的分泌物中取得標(biāo)本。呼吸道又分為上呼吸道和下呼吸道，前者主要包括鼻、咽、喉;后者主要包括氣管、主支氣管及肺內(nèi)各級(jí)支氣管。

相應(yīng)地，現(xiàn)在對(duì)疑似患者檢測(cè)病毒核酸，標(biāo)本的采集一般有兩大類，上呼吸道標(biāo)本和下呼吸道標(biāo)本。

上呼吸道標(biāo)本主要包括口咽拭子、鼻咽拭子(NPS)、鼻咽吸取物(NPA);下呼吸道標(biāo)本主要包括痰液、氣管吸取物、支氣管肺泡灌洗液(BALF)等。

新型冠狀病毒的核酸檢測(cè)流程

對(duì)于新型冠狀病毒的核酸檢測(cè)，首先根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)”樣本要求“部分進(jìn)行樣本采集，常規(guī)的樣本類型包括咽拭子、鼻拭子、痰液、支氣管灌洗液、肺泡灌洗液等。

獲得患者樣本后，需盡快進(jìn)行檢測(cè)，如無(wú)法立即檢測(cè)需要轉(zhuǎn)運(yùn)的樣本，應(yīng)按照說(shuō)明書(shū)的要求進(jìn)行低溫封裝，并送到專門的檢測(cè)機(jī)構(gòu)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)機(jī)構(gòu)收到樣本后，對(duì)樣本進(jìn)行核酸提取，核酸提取試劑應(yīng)使用批準(zhǔn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中指定的核酸提取試劑盒。

病毒RNA需要首先逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，再進(jìn)行擴(kuò)增檢測(cè)。PCR擴(kuò)增和檢測(cè)應(yīng)使用批準(zhǔn)產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)中指定的熒光定量PCR儀，通過(guò)熒光定量PCR所得到的樣本Ct值的大小，可以判斷患者樣本中是否含有新型冠狀病毒。

上述過(guò)程中樣本的采集、保存、轉(zhuǎn)運(yùn)，樣本核酸的提取和檢測(cè)、結(jié)果的判讀均須嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行。

新型冠狀病毒核酸檢測(cè)原理

檢測(cè)新型冠狀病毒特異序列的方法最常見(jiàn)的是熒光定量PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))。因PCR反應(yīng)模板僅為DNA，因此在進(jìn)行PCR反應(yīng)前，應(yīng)將新型冠狀病毒核酸(RNA)逆轉(zhuǎn)錄為DNA。在PCR反應(yīng)體系中，包含一對(duì)特異性引物以及一個(gè)Taqman探針，該探針為一段特異性寡核苷酸序列，兩端分別標(biāo)記了報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收;如反應(yīng)體系存在靶序列，PCR反應(yīng)時(shí)探針與模板結(jié)合，DNA聚合酶沿模板利用酶的外切酶活性將探針酶切降解，報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子產(chǎn)生。熒光定量PCR儀能夠監(jiān)測(cè)出熒光到達(dá)預(yù)先設(shè)定閾值的循環(huán)數(shù)(Ct值)與病毒核酸濃度有關(guān)，病毒核酸濃度越高， Ct值越小。不同生產(chǎn)企業(yè)的產(chǎn)品會(huì)依據(jù)自身產(chǎn)品的性能確定本產(chǎn)品的陽(yáng)性判斷值。